1. gyakorlat

Enzimkinetika és enzim-inhibíciós kinetika

A gyakorlat célja, hogy a hallgatók a BIM előadásokon tanult elméleti enzimkinetikai ismereteiket saját kezűleg elvégzett mérésekkel és számításokkal támasszák alá.

Felkészüléshez szükséges anyagrészek: BIM jegyzet enzimkinetika fejezete (24-77 oldal), BIM példatár enzimkinetikai feladatai.

Balesetvédelem:

A laboratóriumban az általános munkavégzési szabályok érvényesek. Ártalmatlan vizes olda­tokkal, illetve enyhén mérgező és irritatív kémiai anyagok kis mennyiségeivel kell dolgozni. Tűz- és robbanásveszély, biohazard, rádioaktivitás nincs.

Elméleti alapok

A mérések során modellként az Aspergillus oryzae penésztörzs által termelt β-galaktozidáz (laktáz) enzimet vizsgáljuk, amellyel jól bemutatható az enzimek általános működése. Ez az enzim di- és oligoszacharidokban az 1 szénatom béta térállású glikozidos kötésével kapcsolódó galaktóz egységet ismeri fel, és ezt a kötést hidrolizálva galaktózt szabadít fel. Leggyakoribb szubsztrátja a tejcukor (laktóz), amely galaktóz(1→4)glükóz diszacharid, amely a hidrolízis során galaktózra és glükózra bomlik.

A kinetikai vizsgálatokhoz először a reakciósebesség mérését kell megoldani. Ez történhet a szubsztrát fogyásának, vagy a termék felhalmozódásának mérésével. Esetünkben a kiindulási és termékmolekulák túlságosan hasonlítanak egymáshoz (cukrok), emiatt nehéz lenne szelektív kémiai reakcióval analizálni. Az általános gyakorlat szerint a méréshez szubsztrátként laktóz helyett egy másik β-galaktozidot használnak, amely színes(sé tehető) funkciós csoportot (kromofórt) tartalmaz. Kémiai neve orto-nitrofenil-β-D-galaktopiranozid (ONPG), az enzimes hidrolízis hatására a galaktóz mellett orto-nitrofenol keletkezik. A fenolos OH csoport erősen lúgos közegben disszociál, és fenolát anion keletkezik, amely sárga színű, fotométerrel koncentrációja meghatározható.

A reakciósebességet az adott körülmények között, ismert idő alatt termelődött o-nitrofenol mennyiségéből számítjuk.

Szükséges oldatok:

Alappuffer: pH = 4,5 (0,1 n foszfát puffer, amely 10 mM KCl-ot és 1 mM MgCl₂-ot tartalmaz) (500 ml-re: KH₂PO₄ 6,8 g, KCl 0,3725 g, MgCl₂.6H₂O 0,2165 g)

Szubsztrát oldat: 13,29 mM-os ONPG, a fenti pufferben oldva (200 mg/50 ml)

Enzim oldat: 0,65 Unit/ml β-galaktozidáz (Aspergillus oryzae, SIGMA) (5 mg poralakú pre­parátum/ 50 ml alappuffer)

Leállító oldat: 1 M Na₂CO₃ (53 g vízmentes nátrium-karbonát/ 500 ml vízben oldva)

Inhibitor oldatok (ismeretlenként kiadva): I1, I2

Feladatok

1. Enzim inhibíció kinetikai vizsgálata

Külön területe az enzimkinetikának az inhibitorok hatásának vizsgálata. A mérés során állandó mennyiségű (aktivitású) enzim jelenlétében felvesszük a szubsztrát koncentráció - reakciósebesség görbét inhibitor nélkül (ez a klasszikus enzimkinetika alapja), majd vizsgáljuk a katalizált reakció sebességét különböző szubsztrát és inhibitor koncentrációk esetén. A szükséges szubsztrát-, inhibitor- és puffer bemérések (mikroliterben):  

A reakciósebesség mérése:

1 cm-es műanyag küvettában összemérjük a megadott mennyiségű oldatokat, 1,20 cm³ végtér­fogattal. A küvettákat 30 ºC-os termosztátba állítjuk és kb. 5 perc melegítés után hozzáadjuk a 200 μl enzim oldatot. A reakciót pontosan 5 percig futtatjuk, majd 2x1,00 cm³ nátrium-karbonát oldattal leállítjuk. A reakcióban felszabadult o-nitrofenol (ONP) ezen a pH-n erős sárga színt ad, amelynek intenzitását 420 nm-en fotométerrel mérjük. Az abszorbanciából a megadott ka­librációval kiszámítjuk a reakció sebességét μmól ONP/percben. Vak oldatként használjunk alappuffert.

Az ONP mérés kalibrációs egyenlete:

ONP koncentráció (mM/l) = 0,258 * E₄₂₀ + 0,0052

ONP mennyisége (μmol)  = 3,4 * (0,258 * E₄₂₀ + 0,0052)

Reakciósebesség (μmol ONP/perc) =   3,4 * (0,258 * E₄₂₀ + 0,0052)/5

A kapott értékeket kétféleképpen értékeljük ki:

1.      Egy tetszőlegesen megválasztott, nem-lineáris regresszió számítására alkalmas prog­ramcsomaggal hiperbolát illesztünk az adatokra és vizsgájuk a kapott paramétereket.

2.      Linearizálással: táblázatosan kiszámítjuk a v, 1/v, S/v és v/S értékeket. Az S és I koncentrációk a mintajegyzőkönyvben találhatók.

Ábrázoljuk a Michaelis-Menten összefüggést diagramon (v - S)!

A mért adatsorokra egyeneseket illesztünk, és megvizsgáljuk az elrendeződésüket:

-  Lineweaver-Burk ábrázolásban (1/v - 1/S)

-  Hanes-Langmuir ábrázolásban (S/v – S)

-  Hofstee ábrázolásban (v/S - v)

-  Dixon ábrázolásban (1/v - I)

Beadandók:

A mérést két csoportban külön végzik el a hallgatók, mindkét csoport más inhibitort kap. Mind­két team a saját méréséről külön jegyzőkönyvet készít a letölthető mintához hasonló formátum­ban, ezek külön jeggyel kerülnek értékelésre.

A jegyzőkönyv tartalmazza:

-   a mérési előiratot lemásolni nem kell, elég hivatkozni rá, az esetleges eltéréseket viszont fel kell tüntetni;

-   a mért és számított értékeket táblázatos formában;

-   az adatok grafikus megjelenítése, diagramok;

Ø  ábrázolják a Michaelis-Menten hiperbolákat egy tetszőlegesen választott, nemlineáris regresszió számítására alkalmas program segítségével. Adják meg a program nevét, a kinyomtatott görbéket és a program által megadott paramétereket.

Ø  ábrázolják az adatokat mind a négy tanult linearizálási módszerrel. Ezt javasolt, de nem kötelező Excel programmal elvégezni.

Ø  A Lineweaver-Burk ábrázolás adataiból készítsenek másodlagos ábrázolást (tgα -I)!

-   szöveges értékelés:

Ø  Látható-e olyan eltérés, ami mérési hibára utal? Célszerű-e egy-két nyilvánvalóan hibás pontot elhagyni?

Ø  Mi észlelhető a linearizálásokkal kapott egyenesek elrendeződésén? Milyen mértékben egyeznek a kapott képek az elméletivel?

Ø  Melyik típusba sorolható be az inhibíció? (indoklás)

Ø  Mennyinek adódik a v_max és K_M értéke a különböző kiértékelésekkel? Milyen az egyezés a nem-lineáris regresszióval kapott és a linearizálásokkal kapott paraméterek között?

Ø  Mennyinek adódik a K_i értéke a másodlagos ábrázolásból?

Ø  Mennyi lehet az enzim maximális váltásszáma (a vizsgálat körülményei között), ha a móltömege 105 kDa, és a bemért poralakú enzimpreparátumnak csak 15 %-a aktív fe­hérje? A számoláshoz használják a kiértékelésnél kapott v_max értékek átlagát!